大約30年前，科學(xué)家首次描述了DNA測序的Sanger法（Sanger et al.,1977）?，F(xiàn)今DNA測序仍使用這項獲諾貝爾獎的技術(shù)。測序過程中通過聚合酶結(jié)合作為鏈終止子的雙脫氧核糖核苷酸(ddNTP)，接著進(jìn)行分離，分離介質(zhì)必須可區(qū)分出單個堿基長度的差別ddNTP在DNA核酸的3′末端無羥基基團(tuán)，因此，當(dāng)聚合酶結(jié)合一個ddNTP摻入到合成鏈時，鏈的延伸終止。反應(yīng)體系中含有dNTP和ddNTP，部分DNA分子能夠繼續(xù)延伸。測序反應(yīng)結(jié)束時反應(yīng)混合液中含有一系列相互之間只相差一個堿基的分子。
圖1說明了Sanger測序法的過程。每一條DNA鏈均在獨(dú)立反應(yīng)中用單一引物進(jìn)行測序，通常采用的是正向或反向PCR引物。用四種不同顏色熒光染料標(biāo)記四種不同的ddNTP。紅色染料標(biāo)記ddTTP（胸腺嘧啶），藍(lán)色染料標(biāo)記ddCTP（胞嘧啶），綠色染料標(biāo)記ddATP（腺瞟呤）和黃色染料標(biāo)記ddGTP(鳥瞟呤)，為了清晰分辨，黃色染料標(biāo)記在屏幕上顯示為黑色。熒光染料標(biāo)記，以及自動化檢測系統(tǒng)和毛細(xì)管電泳簡化了DNA測序，人類基因組計劃就是采用這些測序按術(shù)成的。
Taq聚合酶在堿基結(jié)合過程中常常有很高的背景干擾，且結(jié)合率低，在過去IO年里，各種DNA測序法從單一的Taq聚合酶發(fā)展到今天所用的平衡性較好的Big Dye試翔盒。采用更易被熒光激發(fā)的染料提高了信噪比( Lee et a1．，1997)，現(xiàn)在可從較少的檢材中獲得結(jié)果?，F(xiàn)今每個DNA測序反應(yīng)中僅需要Ing mtDNA PCR產(chǎn)物(Stewart et a1．，2003)。
DNA模板 3′-TAAATGATTCC-5′
5′--------→------→3′
引物退火 A● ddNTP終止延伸
AT● 產(chǎn)物以一個堿基的差額
ATT● 依次遞增
ATTT●
ATTTA● 每種ddMP標(biāo)記不同
ATTTAC●
ATTTACT● 顏色的熒光染料
ArrTACTA●
ATTTACTAA●
ATTTACTAAG●
ATTTACTAAGG●
ATTTACTAAGG 根據(jù)電泳圖譜中蜂的顏色確定序列
270 2 （進(jìn)行單堿基檢測）
圖1熒光標(biāo)記ddNTP的DNA測序過程
設(shè)計好的引物識別DNA模板的特定區(qū)域且發(fā)生退火，并在酶的作用下延伸。因為混合物中含有代表四種核苷酸的dNTP和ddNTP，一些延伸產(chǎn)物由于結(jié)合了一種ddNTP產(chǎn)生終止，而另外一些繼續(xù)延伸。每種ddNTP用不同的染料標(biāo)記使每種延伸產(chǎn)物能以顏色區(qū)分。DNA序列的讀取基于延伸產(chǎn)物的片段大小，測序依賴的介質(zhì)必須足以分清每個堿基。
mtDNA測序PCR含下列幾個步驟：①利用下列各種引物對整個或部分控制區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；②去除PcR反應(yīng)中殘留的引物和dNTP，可以采用Microcon 100超濾法過濾或用蝦一堿性磷酸酶核酸外切酶I進(jìn)行酶消化（Dugan et al ．，2002）；③對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量(Wilson et al.,1995a,1995b)；④完成PCR測序反應(yīng)，每個反應(yīng)管中有一段不同的引物以及熒光標(biāo)記的 ddNTP，這些引物可表明所檢測的DNA鏈；⑤通常采用微柱過濾法去除在測序反應(yīng)中未結(jié)合的熒光標(biāo)記終止劑；⑥用甲酰胺稀釋純化后的測序產(chǎn)物并利用毛細(xì)管電泳或凝膠系統(tǒng)來進(jìn)行分離；⑦進(jìn)行序列分析及序列信息解釋。
DNA序可以利用一系列儀器完成，包括ABI 310、ABI 3100和ABI377( Stewart et a1．，2003)。可用多色熒光檢測儀進(jìn)行STR分析和mtDNA測序，其根本區(qū)別在于進(jìn)行DNA序列分析要求分離介質(zhì)必須能夠區(qū)分單個堿基，而STR分型則無此嚴(yán)格要求。DNA測序常用POPTM-4分離膠，而STR分型采用POPTM-4分離膠，這種凝膠具有較低的黏性和分離度。
