目前法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室用于基因組DNA定量最普遍的方法就是所謂的“斑點(diǎn)雜交”法。此方法對(duì)人類和其他靈長(zhǎng)類DNA具有特異性,因?yàn)樗囊欢?0bp的探針與靈長(zhǎng)類特異的僅衛(wèi)星DNA序列D1721互補(bǔ),此序列位于17號(hào)染色體。斑點(diǎn)雜交法早期使用放射性探針,經(jīng)修改和商業(yè)化后使用化學(xué)發(fā)光或比色檢測(cè)技術(shù)。
斑點(diǎn)雜交法首先是將基因組DNA點(diǎn)在尼龍膜上,然后加入人類特異性探針,比較樣品和一系列標(biāo)準(zhǔn)品的信號(hào)強(qiáng)度。斑點(diǎn)雜交是相對(duì)定量法,將已知濃度的樣品DNA進(jìn)行梯度稀釋后得到一系列標(biāo)準(zhǔn)品,未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)品比較得出未知樣品的濃度。由于斑點(diǎn)雜交膜上的未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)是用肉跟來(lái)辨別的,所以易受分析者的主觀影響。采用CCD照相圖像系統(tǒng)的數(shù)碼抓捕和斑點(diǎn)雜交圖像定量可以改善其分析過(guò)程。
通常,一張斑點(diǎn)雜交膜上可同時(shí)檢測(cè)30個(gè)樣品,待測(cè)樣品兩側(cè)分別加6—8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品用來(lái)比對(duì)。如20ng、10ng、5ng、2.5ng等。一般用于此定量實(shí)驗(yàn)的DNA模板量是5ul。
此項(xiàng)檢測(cè)要耗費(fèi)幾個(gè)小時(shí)來(lái)完成,但相當(dāng)靈敏,因?yàn)樗蓹z測(cè)單鏈和雙鏈DNA,其檢測(cè)量低至約150pg或50個(gè)拷貝的人類基因組DNA。150pg標(biāo)準(zhǔn)DNA的X線膠片感光核檢測(cè)只需15分鐘。對(duì)于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法,通過(guò)延長(zhǎng)X線膠片曝光時(shí)間和在膜上點(diǎn)更稀濃度的DNA標(biāo)準(zhǔn)品,可將靈敏度提高到150pg以下。有報(bào)道通過(guò)長(zhǎng)達(dá)3個(gè)小時(shí)的曝光可檢測(cè)到10~20pg水平。一些法醫(yī)工作者甚至雜交檢測(cè)看不到結(jié)果時(shí),繼續(xù)進(jìn)行DNA分析,還經(jīng)常能獲得成功的STR分型。所以,斑點(diǎn)雜交定量并不像期望的那樣靈敏。
在2004年初,ABI公司推出了商品化斑點(diǎn)雜交定量產(chǎn)品,稱為Quant-iBlot人類DNA定量試劑盒。這個(gè)試劑盒用17號(hào)染色體上的一段DNA探針檢測(cè)樣本中人類DNA濃度的水平。應(yīng)切記此項(xiàng)技術(shù)雖是“人類特異性”檢驗(yàn),但對(duì)黑猩猩和大猩猩之類的靈長(zhǎng)類動(dòng)物也呈陽(yáng)性,因人類和其余靈長(zhǎng)類動(dòng)物DNA序列存在相似性。