基本原理是雙脫氧末端終止法，標記物選擇熒光染料。熒光染料標記有2種方法：一種是標記引物，另一種是標記終止物ddNIP。熒光染料標記引物，操作方法相對復雜，如果選用一種熒光染料標記，則要分A、c、G、T四個單獨的測序反應，然后再分別上樣分析。如果用四種染料分別標記引物，按雙脫氧ddNIP的不同分A、c、G、T四個單獨的測序反應，上樣時可將四個測序反應產(chǎn)物混合，合并在一個泳道內電泳，因此，熒光標記終止物ddNIP測序更有優(yōu)勢。將四種熒光染料分別標記在四種終止物ddNIP上，一個反應管內畏口可完成測序反應，操作簡單、快速，對引物的選擇、設計無特殊要求。該項技術的特征是測序反應后每一引物鏈延伸產(chǎn)物都因ddNIP標記物帶有不同熒光染料，可在同一個泳道上樣，經(jīng)電泳分離后依據(jù)頗色將不同熒光波長特征性的譜帶分開，同時激光檢測器同步掃描，激發(fā)出的熒光經(jīng)光柵分光后CCD(charge coupled device)攝像機上同步成像，再傳人電腦，經(jīng)軟件分析可區(qū)別不同熒光區(qū)帶，并確定靶片段的堿基序列。四色熒光染料標記終止物ddNTP的方法具有以下特點：①四個測序反應產(chǎn)物可以安排在一個泳道內電泳，避免了多個加樣泳道間遷移率差異對精確度的影響。一次電泳分析的樣品數(shù)可達36個或48個，改進電泳設備甚至可同時分析96個樣品，檢測效率明顯提高。②技術方法簡化，準確性高，序列結果穩(wěn)定，克服了同位素標記方法的放射性污染缺點。③靈敏度高，極少量的PCR擴增產(chǎn)物如30ng就可以滿足模板線性擴增的需要，獲得足夠量的序列分析產(chǎn)物，產(chǎn)生足夠強的熒光信號。④測序能力強，速度快，高達200bp／J、時，36cm長的凝膠板可以準確測定900個堿基。⑤電泳分離自動化，應用DNA分析軟件自動收集、處理和分析數(shù)據(jù)，大大降低了人工操作的勞動強度。⑥實驗結果自動存儲在計算機內，而且可以應用軟件系統(tǒng)對資料作快速的查詢。
      目前，已報道的熒光染料很多，PE公司產(chǎn)品主要有兩種試劑盒，其他公司如Pharmacia公司的測序試劑盒，選用的熒光染料與PE公司基本相同。
      (1) Dye Temunation Cycle Sequencing Terminator kit (P/N402078)
FS測序試劑盒，四色熒光標記物為Rll0、R6G、ROX、TAMRA，引物濃度一般為3.2pmol，反應體積為20til。
      (2) BigDye Termination Cycle Sequencing Terminator kit (P/N4303152)
BigDye測序試劑盒采用的四色熒光標記物為：dR6G、dRll0、dTAMRA、dROX，引物濃度一般為3 .2pmol，反應體積為20vl。
      熒光標記對靶DNA片段直接測序反應的聚合酶，多是利用Taq DNA聚合酶。PE公司的測序試劑盒提供的酶類既有AmpliTaq DNA聚合酶，又有修飾過的T7 DNA聚合酶。Ampli TaqDNA聚合酶是一種超純的熱穩(wěn)定聚合酶，為E．coli Taq DNA聚合酶經(jīng)過修飾表達的產(chǎn)物，具有快速摻入核苷酸的特點。該酶沒有3L5’外切酶的活性，耐94~ 96℃的高溫，因此，是PCR循環(huán)測序較理想的聚合酶。應用Ampli Taq DNA聚合酶循環(huán)測序具有以下特點：
      (1)靈敏度高，對DNA模板量的要求較少，例如測定PCR產(chǎn)物序列僅需30ng模板量則可滿足模板線性擴增的需要，能夠獲得足夠量的序列分析產(chǎn)物，產(chǎn)生足夠強的熒光信號：
      (2)可直接對單鏈、雙鏈DNA模板及PCR產(chǎn)物進行測序，不需要對雙鏈DNA變性，三種測序模板可采用相同的測序方案。但比較起來，對雙鏈的PCR直接測序效果較好。
      (3)較高的反應溫度減少了二級結構對序列測定的影響，使引物鏈能夠更完全的延伸。
      (4)高溫變性、退火減少了模板與引物間非特異性退火的機會，提高測序反應特異性：