如何從各類生物檢材中得到高質(zhì)量的DNA,是法醫(yī)DNA分析鑒定的關(guān)鍵,DNA樣品質(zhì)量的好壞將直接關(guān)系到實驗的成敗。人類基因組DNA 98%以上以染色質(zhì)的形式存在于細胞核內(nèi),僅有少量存在于線粒體中。因此,來自人體組織的有核細胞均可提取到DNA分子。人體組織分結(jié)締組織、肌肉組織、神經(jīng)組織和上皮組織四大類,不同器官組織因其結(jié)構(gòu)不同細胞含量有明顯的差異,有核細胞越豐富的器官組織,DNA含量越豐富,DNA產(chǎn)率越高。正常人體器官組織DNA含量大約為腦>肺>肌肉>腎,有些實質(zhì)性臟器DNA豐富,但人體死亡后降解迅速,故一般不用于法醫(yī)DNA分析,如肝臟、脾臟等。正常人精液中精子數(shù)約為6千萬~2億個/ml,所以,精液中DNA量相對較多。血液中僅白細胞中含有核DNA,白細胞正常計數(shù)值在4百萬—1千萬個/ml,相對而言,血液中的DNA量就少得多了。理論上1個人類體細胞內(nèi)大約含有6×109 bp的DNA,重量約6pg。據(jù)此推斷Iml精液大約可提取0.36~ 1.2mg DNA、Iml血液大約可提取0.024~0.06mg DNA。各種現(xiàn)場物證檢材(包括血痕、精斑及其與陰道分泌物的混合斑、帶毛囊的毛發(fā)、組級塊、骨骼以及沾有唾液斑的煙蒂等),只要含有一定數(shù)量的有核細胞或破碎的細胞核,均可提取到DNA。一些無核細胞檢材,還可提取線粒體DNA進行分析。提取樣本DNA通常分兩個步驟,先是溫和裂解細胞和溶解DNA,接著采用化學(xué)方法去除蛋白質(zhì)、RNA及其他大分子,獲得純化的DNA樣品。這個過程就叫做DNA提取或核酸提取。
較理想的DNA樣品應(yīng)達到以下三點基本要求:
(1)最大程度地去除樣品DNA溶液中的RNA、蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子等成分;
(2)盡可能地保持提取的DNA分子的完整性,這在DNA指紋分析中尤為重要;
為了滿足在法醫(yī)DNA分析中不同檢測技術(shù)對DNA樣品的要求,在DNA提取過程中對DNA的質(zhì)與量需周密考慮。
首先,要考慮樣品DNA的量。不同檢測技術(shù)對DNA樣品的量的要求不同,DNA指紋圖分析要求檢材DNA量達到腭水平以上。PCR技術(shù)因靈敏度高,檢材DNA量一般達到ng水平,甚至pg就可以達到擴增、分型的目的。因此,應(yīng)視檢材具體情況及檢驗方法確定DNA提取方案。
不同的人體組織中DNA含星差異較大,可獲取DNA量也不相同,組織的類型是影響提取DNA量的重要條件。另外一個重要因素是各類案件現(xiàn)場檢材常暴露在外界環(huán)境之中,受到的各種因素影響和損失難以估計。綜合考慮生物檢材的種類、檢材的量、收集方式、收集地點環(huán)境、檢材陳舊度以及檢材基質(zhì)種類等諸多因素,可對樣品DNA量作一粗略預(yù)計,這是在DNA提取前就應(yīng)考慮的問題。
其次,要考慮樣品DNA的質(zhì)量。對法醫(yī)DNA分析而言,高質(zhì)量包括2個重要方面,一是DNA分子能否保持完整的分子結(jié)構(gòu),二是樣品中對內(nèi)切酶、TaqDNA聚合酶活性等有干擾的雜質(zhì)是否完全去除。各類DNA分型技術(shù)對DNA分子的大小要求也不盡相同,但總的原則是盡可能取得完整的DNA,即高分子量DNA,這在DNA指紋圖分析中尤為重要。生物檢材DNA在受到各種理化因素的影響以及來自細菌腐敗與自身組織分解而釋出的蛋白酶、核酸酶的影響時,會發(fā)生降解。DNA長鏈狀分子的降解斷裂點是隨機的,必然嚴重干擾RFIP的檢測與分析。生物檢材越陳舊,提取高分子DNA的可能性越小,這在DNA提取時應(yīng)有充分的估計。DNA分子以染色質(zhì)的形式存在,其機械強度畢竟有一定限度,尤其是DNA與組蛋白分離后,DNA分子變得更加脆弱,任何粗暴的操作、洗滌時所產(chǎn)生的剪切力均可造成DNA分子的損傷和斷裂。在DNA指紋圖分析過程中,在限制性核酸內(nèi)切酶消化步驟前,必須對提取的樣品DNA分子大小作一檢測,因為這是DNA指紋分析成功的關(guān)鍵之一。相比之下,PCR技術(shù)對DNA分子量的要求則沒有這么嚴格,不論采用何種提取技術(shù),盡量去除對DNA分析有關(guān)酶類活性有干擾的物質(zhì)是十分重要的。
DNA提取方法有很多,目前常規(guī)應(yīng)用的方法主要有兩類,有機溶劑提取和Chelex - 100提取法。